Спецпроєкти

Дитина in vitro: як і коли зародилося екстракорпоральне, або штучне запліднення?


Екстракорпоральне запліднення, яке в народі називають штучним, дало можливість багатьом людям з безпліддям стати батьками. Першому успішному заплідненню in vitro передували роки досліджень і невдач, та врешті-решт завдяки відкриттю на світ з’явилося більше мільйона «дітей з пробірки»

bit.ua публікує фрагмент із книжки «Плідна праця» Ольги Малюти, яка вийшла у видавництві «Віхола» і розповідає про весь шлях створення власних ембріонів аж до їх заморожування в лабораторії.

Як і коли зародилося екстракорпоральне, або штучне запліднення?

In vitro з латини перекладається «у склі». Тому часто штучне запліднення називають заплідненням у пробірці — не лише через те, що це лабораторний посуд, а ще й тому, що це скляний посуд. Але латинське слово vitreum («скло») найвдаліше презентує себе в назві процесу вітрифікації.

Коли ми уявляємо собі процес заморозки, то перед нами постають зима, сніг і лід. Але насправді кристали льоду є смертельно небезпечними для всіх живих організмів. За температури нижче від 0 °C вода переходить у твердий стан і формує шестигранну кристалічну ґратку. Через властивості молекули води, бажання утворювати водневі зв’язки між молекулами та через структуру молекули густина льоду є меншою, ніж густина води. Утворена сніжинка займає більший об’єм і простір, ніж така сама за вагою крапля води. Якщо таGка сніжинка сформується всередині клітини, то порозриває всі клітинні мембрани на клаптики, і клітина загине. Ще років 200 тому фізики помітили: якщо надзвичайно швидко заморозити краплю води, можна проминути цей момент кристалізації на позначці в 0 °C. Крапля води не змінить об’єму, не стане кристалічним льодом, а радше набуде характеристик скла.

З 1940-х учені хотіли навчитись моментально заморожувати біологічні об’єкти — ніби оскляти їх, тобто — вітрифікувати. У 1938 році були опубліковані перші результати успішної вітрифікації жаб’ячих сперматозоїдів у зрідженому повітрі (зараз ми використовуємо лише рідкий азот за температури ‒196 °C, без домішки кисню). Ці досліди намагалися повторити багато вчених, і під час однієї спроби в 1949 році випадково відкрили кріопротекторну дію гліцерину. Так почалась ера повільної кріоконсервації живих клітин і тканин. Учені перемкнулися на пошук ефективних хімічних кріопротекторів та розробки способів повільної заморозки. Перша дитина після успішного використання замороженої сперми для інсемінації жінки народилась у 1953 році. Хоча з ооцитами й ембріонами тварин і людини такі методи працювали гірше.

У 1972 році було отримано живе потомство після заморозки жаб’ячого ембріона методом повільної заморозки. Цього вдалося досягти, повільно знижуючи температуру на 0,3 °C на хвилину за наявності одномолярної концентрації кріопротектора диметилсульфоксиду (DMSO). Існує певна група проникних кріопротекторів: вони можуть проникати в клітину, замінюючи в ній воду, і такою дегідратацією захищати від масштабного утворення кристалів льоду під час охолодження. Такими речовинами є також етиленгліколь і пропіленгліколь, але вони мають і дещо токсичний ефект.

Перші досліди із заморожування людських ооцитів та ембріонів почались у 1980-х. Перша дитина після використання кріоконсервованого ембріона народилась у 1983 році, але після першог успіху повільної заморозки надалі всіх чекало розчарування. Рівень виживання ембріонів був досить низьким, часто ставались випадки, коли вся партія заморожених ембріонів не розморожувалась. Виживання ооцитів було на рівні 50%, з низькою імовірністю їхнього запліднення та низьким рівнем утворення бластоцист. Зі 100 заморожених екземплярів до моменту імплантації доходило в середньому 2,3 ооцита.

Трішки покращила ситуацію розробка апаратів-планерів, що дуже чітко контролювали процес повільного та плавного охолодження матеріалу до ‒30 °C, а потім різко охолоджували його до ‒150 °C перед фінальним переміщенням матеріалу в рідкий азот.

З кінця 1980-х учені повертаються до розробки протоколів надшвидкої заморозки ооцитів та ембріонів — і досягають успіху. Успішна вагітність і народження дитини після заморожування ооцитів настає в 1997 році. Обежувальним фактором виявилось навіть не саме заморожування і розмороження, а безпосередньо заплід нення. Ооцити краще заморожувати і вітрифікувати без клітин кумулюсу, а без цих клітин сперматозоїдам важко «побачити» яйцеклітину і проникнути в неї. Тому тут мало зійтися два фактори: і розроблення методу ICSI, і розроблення протоколів заморожування.

Величезна робота була проведена також з розроблення носіїв для біоматеріалу. Повільне заморожування могло бути здійснене у пластикових пробірках об’ємом 1‒2 мл з невеликою кількістю середовища. А от вітрифікація потребувала маленьких девайсів, які фіксували б ембріон чи ооцит і водночас забезпечували б моментальне зниження температури. Так розробили різні соломинки та лопатки для вітрифікації.

Протоколи модифікували й оптимізували досить довго. І сьогодні найбільш активно та ефективно використовують метод вітрифікації, опублікований у 2005 році японським дослідником Масашиго Куваямою. Роботу над його створенням та оптимізацією він почав іще в 1986 році.

У цьому методі використовуються два середовища. Перше — для врівноваження цитоплазми клітин проникними кріопротекторами і часткової дегідратації. Як проникний кріопротектор використовується етиленгліколь. Після першого розчину ооцити чи ембріони вносяться в розчин, де, окрім проникного, є вже і непроникний кріопротектор — одномолярна сахароза. Така концентрація сахарози остаточно висушує ембріон чи ооцит. Цей матеріал переміщують на кріоносій (паличку із силіконовою чи пластиковою лопаткою) і відразу занурюють просто в рідкий азот. Швидкість зміни температури в таких умовах — десь 20000 °C на хвилину. І стається диво: замість сніжинки ми отримуємо «скляну» намистину. Молекули води просто перебувають у такому шоці, що про шестигранну ґратку навіть подумати не встигають. Критичних моментів при заморожуванні є лише кілька: у першому середовищі витримують ембріони й ооцити від 12 до 15 хвилин, а у другому не можна тримати ембріон довше ніж 1,5 хвилини. В останньому середовищі стараються активно відмити ембріон від першого і глазурувати його сахарозою. Також у межах цих 1,5 хвилини потрібно встигнути викласти ембріон чи ооцит на носій. Лише спритність рук ембріолога тут є вирішальною. Потім цю цукрову намистину можна спокійно так само швидко розморозити, і вона виживе. Можна розморозити відразу, а можна років 30 позберігати в рідкому азоті — ефект не зникне.

Коли я бачу вітражі в якомусь середньовічному соборі Європи, я завжди думаю про вітрифікацію. Якийсь такий рефлекс уже. Завжди з теплом згадую, що в нас у Дьюарах зберігаються тисячі таких красивих намистин з водяного скла. Усі — на різнокольорових носіях, направду — як різнокольорові вітражі.

#bit.ua
Читайте нас у
Telegram
Ми в Телеграмі
підписуйтесь